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Informationen für:

Fakultät Life Sciences
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Immobilisierung von Acetylcholinesterase an pörosem Glas (controlled pore glass)

in Anlehnung an: Leon-Gonzalez ME  und Townshend A(1990)Analytica Chimica Acta 236:267-272

 

Chemikalien:

CPG: Controlled pore glass (protein sequencing reagent), 200-400 mesh, pore size 75 Å, SIGMA G-9639.

konz. Salpetersäure: w(HNO3) = 65 %, suprapur, Merck 1.00441.0250

konz. Salzsäure: w(HCl) = 30 %, suprapur, Merck 1.00318.0250

verd. Salzsäure: w(HCl) » 3 %, zu 9 mL Reinstwasser 1 mL konz. Salzsäure zufügen

Glutaraldehyde: Pentan-1,5-dial bzw. Glutaric dialdehyde solution, Grade I, 25% in water, SIGMA G 5882.

di-Na-phosphat: di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, zur Analyse, M = 177,99 g/mol, Merck 1.06580.0500

K-H2-phosphat: Kaliumdihydrogenphosphat,zur Analyse, M = 136,09 g/mol, Baker 0240

3-Aminopropyltriethoxysilane, mind. 98%, SIGMA A-3648

Enzym: Acetylcholine Esterase from Electrophorus electricus, 235 U/mg, EC 3.1.1.7, Fluka 01023  oder Cholinesterase, Acetyl from electric Eel, 275 U/mg, EC 3.1.1.7, Type VI-S, SIGMA C-3389 .

 

Benötigte Lösungen:

Silanisierungsreagenz:
In ein 25 mL Becherglas werden 4 mL Reinstwasser vorgelegt, 1 mL 3_aminopropyltriethoxysilane zugegeben und nochmals 4 mL Reinstwasser addiert. Zu dieser Mischung werden 500 µL konz. Salzsäure gegeben und der pH-Wert mit pH-Papier bestimmt. Ist er unter 3, werden in 50 µL Schritten (ca. 100 µL) Aminopropyltriethoxysilane zugegeben, so dass gerade wieder ein Umschlag ins schwach Saure erfolgt und anschließend wird tropfenweise mit verd. Salzsäure der pH –Wert auf 4 (optimal zwischen 3,5 und 4,0) eingestellt.

Phosphatpuffer mit c(Phosphat-P) = 0,1 mol/L:

Lsg A: 13, 6 g K-H2-Phosphat werden in 246,4 g Wasser (Summe 260 g) gelöst.

Lsg B: 17,8 g di-Na-phoshat werden in 242,2 g Wasser (Summe 260 g) gelöst.

25 mL A und 75 mL B werden in ein 500 mL Becherglas gegeben und auf ca. 400 mL mit Reinstwasser aufgefüllt. Anschließend wird Lsg A oder Lsg B 1:4 (z.B. 10 mL im Messzylinder auf 40 mL) verdünnt und damit der pH-Wert auf 8,0 eingestellt, 20 mL davon für das Kupplungsreagenz entnommen und anschließend der pH-Wert auf 7,5 eingestellt.

Kupplungsreagenz:
In einen 10 mL Messkolben werden ca. 2 mL Phosphatpuffer vorgelegt und der Inhalt von einer Ampulle (1 mL) Glutaraldehyde mit Puffer (pH = 8,0) quantitativ in den Messkolben überführt. Dann wird bis zur Marke mit Puffer aufgefüllt.

Enzymlösung:
In einem 1,5 mL Eppi werden 1 mL Puffer (pH = 7,5) gegeben und in den Kühlschrank gestellt. Nach Abkühlen auf ca. 4°C werden hierin ca. 2,5 mg Enzym gelöst.

 

Durchführung der Immobilisierung
0,2 g CPG werden in einen 50 mL Erlenmeyerkolben abgewogen und mit 1 mL konz. Salpetersäure versetzt. Nach kurzem (ca. 1 min) Einwirken werden 10 g Reinstwasser zugesetzt und der Erlenmeyerkolben mit den Glaskügelchen und der ca. 6 %-igen Salpetersäure wird bei 90 °C im Wasserbad 30 min unter gelegentlichem Schütteln (ca. alle 5 min) erwärmt. Anschließend wird die Suspension aus dem Bad genommen und nach Abkühlen wird dekantiert und drei mal mit jeweils 20 mL Reinstwasser gespült und dekantiert. Die befeuchteten Glaskügelchen werden dann über Nacht im Trockenschrank bei 95 °C getrocknet und nach Abkühlen im gleichen Erlenmeyerkolben mit ca. 10 mL Silanisierungsreagenz versetzt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend 2½ h bei 75 °C im Wasserbad unter gelegentlichem Schütteln (ca. alle 15 min) erwärmt. Anschließend wird die Suspension aus dem Bad genommen und nach Abkühlen wird dekantiert und drei mal mit jeweils 20 mL Reinstwasser gespült und dekantiert. Die mit geringer Reinstwassermenge befeuchteten Glaskügelchen werden nun im gleichen Erlenmeyerkolben bei 90 °C in den Trockenschrank gestellt. Nach ca. 30 min können die gereinigten noch nicht völlig trockenen, jedoch 90 °C warmen silanisierten Glaskügelchen mit dem Kupplungsreagenz umgesetzt werden. Hierzu wird das Kupplungsreagenz zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln (ca. alle 5 min) die Reaktion, bei der eine deutliche Färbung ins rötliche zu beobachten ist, abgewartet. Es erfolgt wieder ein Spülschritt (dekantiert und drei mal mit jeweils 20 mL Reinstwasser gespült und dekantiert) und dann werden die Gläskügelchen in die kalte Enzymlösung überführt und im Kühlschrank mindestens 3 h Reaktion abgewartet.

 

Letzte Änderung: 13.10.11

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