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Fakultät Life Sciences
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Imobilização da Acetilcolinesterase em CPG (controlled pore glass)

( analogo M.E. Leon-Gonzalez e A. Townshend (1990) Analytica Chimica Acta 236: 267-272)

 

Reagentes:

CPG: Controlled pore glass (protein sequencing reagent), 200-400 mesh, diametro dos poros 75 Å, SIGMA G-9639.

Ácido Nítrico concentrado: w(HNO3) = 65 %, , Merck 1.00441.0250

Ácido Clorídrico concentrado: w(HCl) = 30 %, grau PA, Merck 1.00318.0250

Solução de HCl diluida: w(HCl) » 3 %, adição de 1mL de ácido clorídrico concentrado em 9 mL de água destilada.

Glutaraldeído: Pentan-1,5-dial (solução Glutaraldeído, grau I, 25% em água), SIGMA G 58822,5%

Hidrogenofosfato de sódio: Na2HPO4 , grau PA, M = 177,99 g/mol, Merck 1.06580.0500

K-H2-phosphat: dihidrogenfosfato de potássio, grau PA, M = 136,09 g/mol, Baker 0240

3-Aminopropiltrietoxisilano, pureza 98%, SIGMA A-3648

Enzima: Acetilcolinesterase de Electrophorus electricus(electric Eel), 235 U/mg, EC 3.1.1.7, Fluka 01023, 275 U/mg, EC 3.1.1.7, Type VI-S, SIGMA C-3389 .

 

Preparo das solucoes:

 

Reagentes para Silanização:

Foi adcionado 4 mL de água destilada em um balão volumétrico de 25 mL, posteriormente foi adicionado 1 mL 3-Aminopropyl-triethoxysilane e novamente 4mL de água destilada. Nesta mistura adicionou-se 500 µL de ácido clorídrico concentrado e o pH foi controlado com papel indicador de pH (Merck). Nestas condicoes obteve-se um pH = 3,  então foi necessário adição gota a gota de 50 µL (ca. 100 µL) de solução de aminopropiltrietoxisilano para optimização do valor do  pH –  4 (ótimo entre 3,5 e 4,0).

 

Tampão fosfato, c = 0,1 mol/L:

solução A: foi adicionado 13, 6g de dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) em 246,4g de água (em total de 260 g).

solução B: foi adicionado 17,8g de Hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4) 242,2 g de água (em total de 260g).

Foi adicionado 25 mL A e 75 mL B em um beker de 500 mL e completou-se o volume com água destilada (ca. 400 mL).

Posteriormente misturou-se as solucoes A ou B ca. 1:4 com água (por exemplo em uma proveta) e controlou-se o pH para 8,0. Em seguida, tomou-se 20 mL desta solução para o reagente acoplante. Para o restante da solução o pH é controlado até 7,5.

 

Reagente acoplante:

Em um balão volumétrico de 10,0 mL, adicionou-se cerca 2,0 mL tampão fosfato (pH = 8,0), em seguida (1 mL) Glutaraldeído. Completou-se o volume com  tampão fosfato (pH = 8,0).

 

Solução da Enzima:

Em um frasco Eppi de 1,5 mL adicionou-se 1 mL tampão fosfato (0,1 mol.L-1, pH = 7,5) frio  (4°C). Em seguida, foi adicionado acetilcolinesterase (cerca de 2,5 mg - 275 U/mg) e dissolvida. A mistura foi mantida em geladeira a temperatura de 4oC.

Procedimento de Imobilização:

 

Pesou-se diretamente cerca de 0,2 g de bolinha de vidro de porosidade controlada (CPG) em um erlenmeyer de 50 mL com 1,0 mL de ácido nítrico concentrado, e em seguida adicionou-se cerca de 10g de água destilada. A mistura de CPG com solução de cerca de 6% de ácido nítrico foi à banho maria para aquecimento (ca 90 °C) por 30 minutos, com agitação a cada 5 minutos. Posteriormente retirou-se o erlenmeyer do banho, descartando-se a soluçãoa em suspensão. Labou-se o CPG por 3 vezes, cada uma com 30mL de água destilada, sempre esperando a decantação do CPG e descartando a solução em suspensão o sobrenadante. Em seguida o CPG contido no erlenmeyer foi levado em estufa a 95 °C por 30 minutos para secar. Depois de seco esperou-se o CPG esfriar, e adicicionou-se 10 mL do reagente silanizante. Proceguiu-se a reação por  2½ h em banho maria (75°C), sob agitação(ca. cada 15 min), verificando-se uma significante mudança de cor para rosa-ferrugem durante a reação. Em seguida, a solução em suspensão foi descartada, e o CPG lavado com 20 mL de água destilada. Repetiu-se o procedimento de lavagem por 3 vezes. Levou-se o CPG para estufa para cecar em temperatura 90°C. Depois de 30 minutos, adicionou-se a solução de acoplamento glass beads silanizado e seco e a reação foi continuada sob agitação (ca. cada 15 min) em temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente, descartou-se novamente o sobrenadante, lavou-se o CPG lavado com 20 mL de água destilada por 3 vezes. Em seguida, a solução de acetilcolinesterase foi adicionada ao CGP e a mistura foi deixada em repouso por 3,0 h para completa reação h a 4oC. A enzima imobilizada em CPG foi lavada primeiramente com tampão fosfato e posteriormente com água deionizada. A enzima imobilizada foi estocada em tampão fosfato em uma  geladeira a 4oC para uso posterior.

Letzte Änderung: 13.10.11

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